Preparasi Sampel dalam Proteomik

Pada artikel ini akan dijelaskan mengenai pentingnya preparasi sampel dalam suatu analisis, langkah-langkah preparasi sampel, beberapa teknik yang digunakan untuk memisahkan dan menempatkan sampel, khususnya sampel biologis, serta tantangan dan hambatannya dalam bidang proteomik.
Preparasi Sampel dalam Proteomik
Ilustrasi Preparasi Sampel

Mungkin kamu bertanya-tanya...

Kenapa perlu adanya preparasi?

Kualitas dan keakuratan informasi yang diperoleh dari analisis proteomik sangat bergantung secara kritis pada kualitas tahap preparasi sampel.

Oleh karena itu, pendekatan proteomik untuk menangani identifikasi protein yang akurat dan interaksinya menuntut metodologi analisis yang sangat tepat, tidak ambigu, dan dapat dipercaya.

Preparasi sampel menentukan semua prosedur dan protokol lebih lanjut, dan harus direncanakan secara menyeluruh. Dalam artikel ini akan berfokus pada aspek utama penyusunan bahan biologis.

Preparasi Bahan Biologis

Proses analisis dimulai dengan pengambilan atau ekstraksi bahan biologis. Gagasan umum selama ini dan langkah selanjutnya adalah meminimalkan jumlah prosedur dan menyederhanakannya.

Semua prosedur harus dilakukan pada suhu 4 oC, dan bahan yang diperoleh harus disimpan pada suhu -80 oC. Karena pembekuan dan pencairan berulang harus dihindari, sampel harus dibagi menjadi beberapa bagian yang lebih kecil.

Bahan kimia dengan kemurnian tertinggi harus digunakan. Sampel akan dipekatkan selama tahap pemurnian, dan apapun (bahkan kecil) pengotor akan dipekatkan bersamaan dengan sampel.

Bahan dari manusia harus diperlakukan dengan perawatan spesial (khusus) dari sudut pandangan kemungkinan terjadinya infeksi atau kontaminasi.

Sampel seperti itu harus diambil dari sumber yang terpercaya (misalnya., laboratorium klinik) dengan informasi singkat mengenai asal-usul dan penyakit, prosedur ekstraksi, anti koagulan, koktail penghambat, dan sebagainya.

Vaksinasi terhadap hepatitis sangat direkomendasikan untuk staf laboratorium. Penggunaan sarung tangan sekali pakai adalah sebuah persyaratan, seperti juga semua izin yang dibutuhkan untuk bekerja dengan bahan biologis, kode etik, standarisasi dan persetujuan rutin untuk pembuangan sampel infeksi dan biologis, dan faktor lainnya.

Tidak ada satupun prosedur universal untuk preparasi sampel. Setiap sampel mempunyai spesifitas tersendiri, dan keseluruhan protokolnya harus disesuaikan dengan kondisi uniknya.

Strategi Preparasi

Protokol (Aturan) pemisahan diperlukan untuk jaringan, cairan tubuh, kultur sel, dan bahan lainnya. Sebagai contoh, jaringan otak berbeda secara signifikan dari jaringan lain, karena mengandung presentase lemak yang tinggi, yang sangat mempengaruhi pemisahan Kromatografi.

Sampel harus dipreparasi berdasarkan tujuan akhir, yang mungkin merupakan urutan yang sederhana, retensi aktifitas biologis atau kemungkinan interaksinya.

Hal ini sangatlah diperlukan untuk menentukan kandungan protein sebelum sampel diproses lebih lanjut.
Langkah-langkah utama dalam preparasi sampel adalah:
  1. Isolasi dan Pengambilan
  2. Ekstraksi
  3. Pemisahan
  4. Desalting (Proses Penghilangan garam) dan Pemekatan

Isolasi dan pengambilan harus dilakukan secara akurat, tanpa mencemari sel tetangga atau darah. Cairan tubuh (misalnya., darah, cairan serebrospinal) sangat diinginkan, karena berfungsi sebagai sumber diagnostik yang berguna dan seringkali mencerminkan perubahan awal dalam phatophysiology dari berbagai penyakit. Cairan serebrospinal yang bahkan sedikit terkontaminasi dengan darah harus ditolak.

Prosedur ekstraksi bergantung pada sifat material. Jaringan biasanya dihomogenisasi dalam buffer es dingin dengan penambahan koktail penghambat untuk menghindari degradasi proteolitik yang tidak diinginkan.

Peptida umumnya diekstrak dari jaringan setelah direbus dalam asam asetat 1 M, diikuti dengan homogenisasi jaringan. Alternatif yang efisien adalah perlakuan microwave pada hewan, sebuah prosedur yang menonaktifkan proteolisis.

Metode paling sederhana, sering digunakan untuk sampel dalam jumlah besar (misalnya urin), adalah teknik salting out, menggunakan ammonium sulfate dan gradien bertahap.

Sampel dipisahkan dan dipekatkan secara efektif, namun tantangannya mungkin adalah dibutuhkan prosedur desalting terlebih dahulu sebelum langkah analisis lebih lanjut.

Langkah pemisahan sering kali terdiri dari beberapa prosedur, tergantung pada kompleksitas sampel. Pendekatan proteomik menggunakan elektroforesis dua dimensi sebagai metodologi yang paling umum digunakan, dengan efisiensi pemisahan yang baik dan resolusi tinggi.

Namun, reproduktifitas dan waktu analisis masih dipertanyakan. Sebagai alternatif, kromatografi cair dua dimensional/spektrometri massa (2-D LC/MS) digunakan dengan kombinasi penukar kation dan kolom fase balik.

Protokol lain melibatkan fokus isoelektrik dalam larutan, diikuti dengan kromatografi. Banyak metodologi kombinasi baru-baru ini telah dipublikasikan, dan disesuaikan dengan jenis sampel individual, ketersediaan teknik, dan sebagainya.

Desalting dan pemekatan sampel dalam bentuk akhirnya biasanya dilakukan dalam satu tahap dengan menggunakan kolom mini fasa terbalik dan ekstraksi fasa padat (SPE).

Perangkat seperti itu mampu memekatkan sampel ke beberapa mikroliter, yang meningkatkan sensitivitas pengukuran secara signifikan. Mini kolom tersebut tersedia secara komersial dan juga dapat disiapkan di laboratorium dengan menggunakan tip pipet dan bahan kemasan massal.

Format kolom SPE dan catridge cocok untuk bekerja dengan sampel biologis (volume terbatas). Ada perangkat SPE mikro sebanyak 96 kolom baik dengan pelat atau kolom mikro yang memungkinkan penanganan mikroliter cairan (2 µL).

Metode yang paling efisien menggunakan kromatografi afinitas dengan sampel yang diperkaya dengan komponen yang diinginkan, tergantung pada antibodi (atau molekul pengikat lainnya) yang digunakan.

Metode ini juga dapat digunakan secara berlawanan untuk menghilangkan bahan biologis dengan komponen yang tidak diinginkan, seperti protein yang paling banyak melimpah di plasma.

Namun ada laporan yang menggambarkan kelemahan metode tersebut, karena banyak komponen penting lainnya juga dihilangkan.

Solid-Phase Extraction (SPE)

Solid-Phase Extraction atau Ekstraksi Fasa Padat merupakan langkah persiapan yang penting sebelum injeksi sampel ke dalam sistem LC. Fungsi utama kartrid SPE adalah memisahkan analit dari bahan matriks yang tidak diinginkan.

Ini mungkin komponen garam, deterjen, atau komponen yang ada dalam sampel. Karakteristik metode SPE adalah ukuran pori-pori (sekitar 40 µm atau lebih), yang lebih besar dari ukuran pori yang digunakan dalam kolom analisis.

Ada dua jenis mode SPE, yaitu online dan off-line, sebagai bagian dari sistem analisis. Dalam pendekatan online, mode pengayaan dan lucutan (stripping) dapat digunakan.

Dalam mode pengayaan analit dipertahankan pada kolom perangkap (dalam banyak kasus, bahan fasa terbalik) dan diperkaya sebelum disuntikkan ke kolom analisis.

Matriks yang terkontaminasi dielusi menjadi limbah. Dalam mode stripping, matriks diadsorpsi pada kolom SPE, dan analitnya dielusi dan dipisahkan pada kolom analisis. Semua pengoperasian dapat dilakukan dengan bantuan sistem katup pengalih otomatis.

Selain fase diam yang paling umum digunakan, ada metode yang kurang populer namun sangat menjanjikan yaitu Restricted Access Material (RAM) dan Molecularly Imprinted Polimer (MIP).

Miniaturasi

Tantangan dalam proteomik dan yang lebih umum, dalam penemuan molekul endogen yang berpusat pada ukuran sampel biologis. Miniaturisasi analitis instrumentasi telah menjadi kekuatan pendorong dalam analisis kimia selama beberapa dekade.

Miniaturisasi membawa banyak keuntungan untuk analisis kimia, termasuk penurunan waktu analisis, konsumsi sampel dan reagen, meningkat sampel, dan kemampuan untuk menganalisa sampel sangat kecil.

Sistem analisis miniaturasi lebih murah untuk memproduksi, dan karena itu biaya analisis akan berkurang.

Bahan harus dipekatkan setelah pemurnian, karena sistem LC dan spektrometer adalah detektor massa (yaitu, semakin tinggi konsentrasi zat, semakin baik respon detektornya).

Ini menghasilkan miniaturisasi kedua sistem LC dan sumber ion (bagian dari spektrometer massa yang bertanggung jawab untuk pengenalan sampel yang efisien ke dalam penganalisis.

Saat ini, sistem nano-LC, yang mempertahankan laju alir dimulai selama 20 nL/menit, dioptimalkan dari 50 sampai 150 µl di dalam diameter kolom yang terhubung ke sumber nanoelectrospray, adalah platform analisis yang paling kuat di bidang proteomik.

Kehilangan Sampel

Kendala utama yang menyebabkan hasil negatif (buruk) adalah kehilangan sampel selama pemindahan (transfer) di antara berbagai langkah preparasi.

Sejumlah bahan biologis bisa teradsorpsi hampir di mana saja. Tip pipet, tabung uji, cartridge, fasa padat, tubing transfer dan kolom kromatografi hanyalah beberapa contoh lokasi di mana sampel dapat teradsorpsi secara ireversibel.

Misalnya, peptide mapping pada tingkat femtomolar rendah, disiapkan sebelum akhir pekan dan disimpan pada suhu -80 oC, biasanya tidak terdeteksi setelah beberapa hari penyimpanan.

Yield pemulihan dapat ditingkatkan sampai batas tertentu dengan menggunakan tabung silikon dan tip pipet serta mengurangi jumlah langkah preparasi.